产品简介

2×Color qPCR Fluore Green Master Mix (High Rox)是2×实时定量PCR扩增预溶液，荧光强度高，灵敏度高和特异性强，扩增产量高。核心组分Taq DNA聚合酶采用抗体法热启动，可以有效抑制样品准备过程中引物退火导致的非特异性扩增；还添加了提升PCR反应扩增效率因子和均衡不同GC含量（30~70%）基因扩增的促进因子，使定量PCR可以在宽泛的定量区域内获得良好的线性关系。

本产品利用不同染料的混合变色反应来监控移液操作，有效减少了移液误差的发生。

产品信息

组分信息

储存条件

-25~-15℃避光保存，有效期1年。

注意事项

1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 解冻后Master Mix可能出现絮状或白色沉淀，手握缓慢溶解并上下轻柔颠倒混匀至溶液澄清，不影响试剂性能。

3. 使用前请上下颠倒以混匀Master Mix，请勿vortex避免产生气泡，影响定量结果。Master Mix经混匀短暂离心后即可使用。加样过程中吹打要轻，如果操作不慎Master Mix起泡，需再次离心方可使用。

4. 由于本品检测灵敏度极高，易被空气中气溶胶污染。因此反应体系配制时请于超净工作台内进行，配制过程中请使用灭菌枪头、反应管，条件容许的实验室推荐使用专用的移液枪和带滤芯的枪头。

5. 推荐使用本公司cDNA合成试剂盒（Cat#N132062），以有效去除RNA样品中残留的基因组。

6. 本产品仅用于科研。

使用说明

1. 模板处理

2× Color qPCR Fluore Green Master Mix (High Rox)中包含蓝色染料，10×Dilution Buffer为专用黄色浓缩模板稀释液。使用过程中，如需要进行模板示踪，则需稀释到1X作为模板稀释液使用，然后进行qPCR检测；如不需要进行模板示踪，则不使用Dilution Buffer即可。

【注】：*实际使用过程中也可按需使用其他方案，保证最终模板中Dilution Buffer浓度为1×即可。

2. 推荐qPCR反应体系

【注】：

*通常引物终浓度为0.2 μM，也可以根据情况在0.1-1.0 μM之间进行调整。

**如模板为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10，最佳模板加入量以保证扩增得到的Ct值在20-30个循环为宜。

***推荐使用20 μL或50 μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性；上机前需充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。

3. 反应程序

【注】：

*退火温度和时间：请根据引物TM值和目的基因的长度进行调整。

**荧光信号采集：请勿忘记打开荧光信号采集，按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置。

***熔解曲线：通常情况下可以使用仪器默认程序。

4. 引物设计指南

1) 推荐引物长度25 bp左右。扩增产物长度150 bp为佳，可以在100 bp-300 bp内选择。

2) 正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超过2℃。引物Tm值60℃-65℃为佳。

3) 引物碱基分布均匀，避免出现连续的4个相同碱基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一个碱基最好为G或C。

4) 引物内部或者正反两条引物间最好避免出现有3个碱基以上的互补序列。

5) 引物特异性需要用NCBI BLAST程序进行核对。避免引物 3’端有2个碱基以上的非特异性互补。

6) 设计完成的引物需要进行扩增效率的检测，只有具备相同扩增效率的引物才可用于定量比较分析。

5. 适用机型

本产品中预混了用以校正孔与孔之间荧光信号误差的ROX Reference Dye 1 (高浓度)，适用于以下荧光定量PCR仪：

Applied Biosystems 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900HT Fast, StepOne, StepOnePlus;

以及其他需要添加高浓度ROX Reference Dye的荧光定量PCR仪。